冠状动脉内灌注法与直接心肌内注射法导基因入心脏的对比研究*
作者：李建军 李庚山 黄从新 许家俐 王晋明 伊丽亚 王 晶
单位：湖北医科大学附属第一医院(430060) 心内科
关键词：腺病素；基因导入；心肌
心肺血管病杂志9901222 摘要 选用含有细菌LacZ基因的重组腺病毒载体对比研究冠状动脉内灌注法(简称冠脉灌注法)与直接心肌内注射法(简称心肌注射法)这两种导基因入心脏方法的不同特点。健康成年杂种狗10只，经股动脉插入冠造导管至左冠状动脉口(5只)和特制针型导管至左室心肌(5只)，注入0.3ml约含1×109 pfu腺病毒载体入心脏。术后3天处死动物，组织化学分析LacZ基因在心脏中的表达。结果表明冠脉灌注法相对无创，基因在心肌中的表达呈弥散性，心肌内血管和外周非靶器官中也见LacZ基因表达。心肌注射法则见基因沿注射轨迹高效率表达并伴有明显的局部炎症反应。本研究提示，导基因入心脏时应根据研究目的合理选用导入途径。
, http://www.100md.com
Comparative Study on Gene Transfer Into Myocardium between
Coronary Artery Perfusion Approach and Direct
Myocardial Injection Method
Li Jianjun,Li Gengshan,Huang Congxin,et al.
Molecular Cardiology Unit,Department of Cardiology,First Affiliated Hospital,Hubei Medical University,Wuhan,Hubei(430060)
Abstract The different features of gene expression were examined following adenovirus-mediated gene transfer into canine myocardium between coronary artery perfusion appreach (CAPA) and direct myocardial injection method(DMIM).Judkins catheter were placed in 5 dogs' left coronary arteries and home-made needle-catheter were injected in myocardium of another 5 dogs' left ventricular free walls.0.3 ml recombinant adenovirus vector containing 1×109 pfu was injected into either left coronary artery or myocardium or left ventricular free wall.The gene expression was evaluated at 3 days after injection by histochemical analysis.The results showed that ①CAPA was relatively less damage and could induce sparse LacZ expression in myocardium.The gene expression was also found in vessels of both myocardium and liver;②The gene transfer by DMIM resulted in intensive LacZ expression arround injection trace of myocardium,which accompanied by local inflammatory response.Our study indicated that reasonable approach should be chosen according to purpose when gene transfer into myocardium will be performed.
, 百拇医药
Key words: Adenovirus;Gene transfer;Myocardium
转基因入心脏可望成为多种心肌疾病治疗的新途径[1～4]。已证实，经直接心肌内注射或间接冠状动脉内灌注含外源基因载体可使心肌细胞摄取及表达外源基因[1～2]。然而，选用同种动物、同等剂量的腺病毒载体导基因入心脏的对比研究国内外尚乏报道。本文将其研究结果报道如下。
材料与方法
1. 重组腺病**** 重组腺病****方法详见文献[1，4～6]。简言之，将细菌LacZ基因插入粘性末端质粒载体的SRa启动子与SV40多聚腺苷酸〔poly(A)〕序列之间。其质粒载体中含有整个人类5型腺病毒的基因组，但已预先去掉其EIa、EIb和E3区使之形成复制缺陷。含有目的基因LacZ的重组腺病毒名命为Adex 1SR LacZ且经293细胞培养同源重组获得，并经常规酶消化法和测定受其感染后细胞中β-半乳糖苷酶的活性而确认。确认后的病毒株经293细胞扩增，尔后经氯化铯密度梯度离心法回收与纯化。病毒滴度采用293细胞受其感染后斑块形成单位(pfu:plaque formation unit)计算，其计算方法参见文献[7]。经该法提取，通常可获得1×1010pfu的高滴度病毒。与此同时，制作不含任何外源基因但结构上与重组腺端病毒完全相同的腺病毒名为Adexlw作为对照。
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2. 活体基因导入心脏 选10～20kg成年杂种狗10只，雌雄不拘。经静脉注射苯巴比妥纳30mg/kg麻醉。右股三角区纵行切口暴露股动脉，穿刺法送入导管套管于股动脉，按下法导基因入心脏。
(1) 冠状动脉内灌注法(简称冠脉灌注法) 经导管套管送入7F Judkins导管至左冠状动脉口。注入少许造影剂证实导管尖端位置后，经导管尾端注入0.3ml约含1×109 pfu Adex 1SR LacZ(n=3)或Adexlw(n=2)于左冠状动脉内(除外导管死腔)。
(2) 直接心肌内注射法(简称心肌注射法) 经导管套管送入特制的4F针型导管(详见参考文献1)于左室游离壁心肌内，经导管尾端注入0.3ml约含1×109pfu Adex 1SR LacZ(n=3)或Adexlw (n=2)于心肌内(除外导管死腔)。
基因导入结束后，拨出导管及导管套管。强力粘着剂封闭穿刺点加压压迫止血，缝合切口。动脉送实验中心，给予普通饮食。术后抗生素治疗3天。
, 百拇医药
3. 组织化学分析 基因导入心脏后3天经静脉注入过量苯巴比妥钠处死动脉。开胸迅速取出心脏及肝脏。经冷生理盐水冲洗心脏后，切取左室游离壁并切成0.5cm薄片置于2%甲醛和0.2%戊二醛的PBS(pH 7.4)液中，于4℃固定12h。PBS冲洗5次，浸泡冲洗10min×3次。随后将组织置于含5 mmol/L铁氰化钾，5mmol/L亚铁氰化钾，1 mmol/L二氯化镁和1 mg/ml X-Gal的PBS液中37℃培养12h。
染色完毕后，生理盐水冲洗组织3次，并将其重新置于含有2%甲醛和0.2%戊二醛的PBS(pH 7.4)液中于4℃固定24h以上。石腊包埋，使用组织切片机将包埋组织切成5μm的切片，核固红(nuclear fast red)染色后显微镜下观察照相。
结果
由于LacZ基因表达的蛋白产物β-半乳糖苷酶与底物X-Gal发生化学反应后呈蓝色，故本实验极易观察到基因是否得到表达及基因表达的部位与范围。图A和C示冠脉灌注法导基因入心脏的组织化学分析结果(图1)。从图A可见LacZ基因在心肌中呈点或小片状表达，组织切片示除心肌中有点状分布的LacZ基因表达外，心脏内血管(图C箭头所示)亦可见LacZ基因表达，但无炎性细胞浸润。图B和D示心肌注射法导基因入心脏的组织化学分析结果。从图B可见LacZ基因沿注射轨迹成块或片状表达，并伴有明显的炎性细胞浸润。而使用两法注射对照腺病毒Adex1w之犬心肌则未见蓝染现象。心肌注射法见有明显的炎性细胞浸润，而冠脉灌注法则未见炎性细胞浸润。
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图1 A 冠脉灌注法导基因入心脏后大体标本(×16)；
B 心肌注射法导基因入心脏后大体标本(×16)；
C 冠脉灌注法导基因入心脏后组织学标本(×50)，箭头示血管蓝染，表明LacZ基因表达；
D 心肌注射法导基因入心脏后组织学标本(×50)；组织中有大量炎性细胞浸润
我们经组织化学分析尚观察到冠脉灌注法导基因犬之肝脏组织有散在呈点状分布的LacZ基因表达，而心肌注射法则不然。说明冠脉灌注法导基因入心脏时，有重组腺病毒随血流遗漏到非靶组织。
讨论
随着心血管分子生物学的兴起，导基因入心脏引人注目。既往研究多侧重于载体选择、导基因后外源基因在心脏中的表达效率及表达时间曲线观察，对方法学及不同方法导基因入心脏的对比研究尚乏报道。本文选用同一载体、同一剂量、同种动物对比研究冠脉灌注法与心肌注射法这两种导基因入心脏方法的不同特点，以其为未来导基因入心脏的基础研究和临床应用提供参考。
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本研究提示冠脉灌注法导基因入心脏具有创伤小，操作简便，可同时将外源基因导入心肌及心肌内血管等优点。适合于以心肌和心肌血管同时为导基因靶组织之研究时应用。但该法导基因入心肌的效率不如心肌注射法，尤其是它可导致外源基因在非靶器官表达，缺乏组织的特异性[3]。为将此法用于未来的临床基因治疗，选用心肌细胞特定启动子和利用心肌细胞特异配体有可能克服此一弊端。
心肌注射法导基因入心脏最初由Dr Li等用于实验研究并引起同道们的极大兴趣[1]，该法能高效率地导基因入心肌局部，其定位性和特异性较好，适合局部心肌为导基因靶组织研究时应用。有希望成为未来的临床基因治疗心脏疾患的主要方法，该法对心肌有一定的损伤作用且可导致局部炎性反应为其不足。有关腺病毒载体导基因入心脏后所致炎症反应机理尚有争议。有作者认为系腺病毒本身侵袭心肌和/或宿主免疫应答所致[4]。但亦有认为系直接心肌注射所致机械性损伤引起[3]。结合本研究结果，我们认为后者的可能性较大。其一，本研究经冠脉灌注法导基因入心脏后未见炎症反应；其二，作者的早期研究使用生理盐水注入心肌亦可引起明显的炎症反应[1]。
, 百拇医药
综上所述，冠脉灌注法和心脏注射法导基因入心脏各有利弊。我们认为应根据研究目的合理选用导入途径。此外，上述二法之弊端亦有待进一步研究克服，以期为未来基因治疗心肌疾病奠定基础。
* 本课题由国家人事部留学回国人员基金资助
参考文献
[1] Li J J,Ueno H,Pan Y,et al.Percutaneous transluminal gene transfer into canine myocardium in vivo by replication-defective adenovirus.Cardiovasc Res，1995,30:97～105.
[2] Lin H,Parmacek MS,Morle G,et al.Expreession of recombinant gene in myocardium in vivo after direct injection of DNA.Circulation,1990,82:2 217～2 224.
, 百拇医药
[3] Barr E,Carroll J,Kalynych AM,et al.Efficient catheter-mediated gene transfer into the heart using replication defective adenovirus.Gene Ther,1994,1:51～54.
[4] Frech BA,Mazur W,Geske RS,et al.Direct in vivo gene transfer into porcine myocardium using replication-deficient adenovirus vector.Circulation,1994,90:2 414～2 426.
[5] Li J J,Ueno H,Yamamoto H,et al.Adenovirus-mediated arterial gene transfer does not require prior injury for submaximal gene expression.Gene Ther,1995,2:351～354.
, 百拇医药
[6] Ueno H,Li J J,Tomita H,et al.Quantitative analysis of gene expression after a repetetive infection into the same arterial wall.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1995,15:2 246～2 253.
[7] 郑志明，见向近敏，郑志明，等主编.医学病毒学.1986，第1版，上海：上海科学技术出版社，538～540.
(1998-05-27收稿)
(1998-09-01修回), 百拇医药
单位：湖北医科大学附属第一医院(430060) 心内科
关键词：腺病素；基因导入；心肌
心肺血管病杂志9901222 摘要 选用含有细菌LacZ基因的重组腺病毒载体对比研究冠状动脉内灌注法(简称冠脉灌注法)与直接心肌内注射法(简称心肌注射法)这两种导基因入心脏方法的不同特点。健康成年杂种狗10只，经股动脉插入冠造导管至左冠状动脉口(5只)和特制针型导管至左室心肌(5只)，注入0.3ml约含1×109 pfu腺病毒载体入心脏。术后3天处死动物，组织化学分析LacZ基因在心脏中的表达。结果表明冠脉灌注法相对无创，基因在心肌中的表达呈弥散性，心肌内血管和外周非靶器官中也见LacZ基因表达。心肌注射法则见基因沿注射轨迹高效率表达并伴有明显的局部炎症反应。本研究提示，导基因入心脏时应根据研究目的合理选用导入途径。
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Comparative Study on Gene Transfer Into Myocardium between
Coronary Artery Perfusion Approach and Direct
Myocardial Injection Method
Li Jianjun,Li Gengshan,Huang Congxin,et al.
Molecular Cardiology Unit,Department of Cardiology,First Affiliated Hospital,Hubei Medical University,Wuhan,Hubei(430060)
Abstract The different features of gene expression were examined following adenovirus-mediated gene transfer into canine myocardium between coronary artery perfusion appreach (CAPA) and direct myocardial injection method(DMIM).Judkins catheter were placed in 5 dogs' left coronary arteries and home-made needle-catheter were injected in myocardium of another 5 dogs' left ventricular free walls.0.3 ml recombinant adenovirus vector containing 1×109 pfu was injected into either left coronary artery or myocardium or left ventricular free wall.The gene expression was evaluated at 3 days after injection by histochemical analysis.The results showed that ①CAPA was relatively less damage and could induce sparse LacZ expression in myocardium.The gene expression was also found in vessels of both myocardium and liver;②The gene transfer by DMIM resulted in intensive LacZ expression arround injection trace of myocardium,which accompanied by local inflammatory response.Our study indicated that reasonable approach should be chosen according to purpose when gene transfer into myocardium will be performed.
, 百拇医药
Key words: Adenovirus;Gene transfer;Myocardium
转基因入心脏可望成为多种心肌疾病治疗的新途径[1～4]。已证实，经直接心肌内注射或间接冠状动脉内灌注含外源基因载体可使心肌细胞摄取及表达外源基因[1～2]。然而，选用同种动物、同等剂量的腺病毒载体导基因入心脏的对比研究国内外尚乏报道。本文将其研究结果报道如下。
材料与方法
1. 重组腺病**** 重组腺病****方法详见文献[1，4～6]。简言之，将细菌LacZ基因插入粘性末端质粒载体的SRa启动子与SV40多聚腺苷酸〔poly(A)〕序列之间。其质粒载体中含有整个人类5型腺病毒的基因组，但已预先去掉其EIa、EIb和E3区使之形成复制缺陷。含有目的基因LacZ的重组腺病毒名命为Adex 1SR LacZ且经293细胞培养同源重组获得，并经常规酶消化法和测定受其感染后细胞中β-半乳糖苷酶的活性而确认。确认后的病毒株经293细胞扩增，尔后经氯化铯密度梯度离心法回收与纯化。病毒滴度采用293细胞受其感染后斑块形成单位(pfu:plaque formation unit)计算，其计算方法参见文献[7]。经该法提取，通常可获得1×1010pfu的高滴度病毒。与此同时，制作不含任何外源基因但结构上与重组腺端病毒完全相同的腺病毒名为Adexlw作为对照。
, http://www.100md.com
2. 活体基因导入心脏 选10～20kg成年杂种狗10只，雌雄不拘。经静脉注射苯巴比妥纳30mg/kg麻醉。右股三角区纵行切口暴露股动脉，穿刺法送入导管套管于股动脉，按下法导基因入心脏。
(1) 冠状动脉内灌注法(简称冠脉灌注法) 经导管套管送入7F Judkins导管至左冠状动脉口。注入少许造影剂证实导管尖端位置后，经导管尾端注入0.3ml约含1×109 pfu Adex 1SR LacZ(n=3)或Adexlw(n=2)于左冠状动脉内(除外导管死腔)。
(2) 直接心肌内注射法(简称心肌注射法) 经导管套管送入特制的4F针型导管(详见参考文献1)于左室游离壁心肌内，经导管尾端注入0.3ml约含1×109pfu Adex 1SR LacZ(n=3)或Adexlw (n=2)于心肌内(除外导管死腔)。
基因导入结束后，拨出导管及导管套管。强力粘着剂封闭穿刺点加压压迫止血，缝合切口。动脉送实验中心，给予普通饮食。术后抗生素治疗3天。
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3. 组织化学分析 基因导入心脏后3天经静脉注入过量苯巴比妥钠处死动脉。开胸迅速取出心脏及肝脏。经冷生理盐水冲洗心脏后，切取左室游离壁并切成0.5cm薄片置于2%甲醛和0.2%戊二醛的PBS(pH 7.4)液中，于4℃固定12h。PBS冲洗5次，浸泡冲洗10min×3次。随后将组织置于含5 mmol/L铁氰化钾，5mmol/L亚铁氰化钾，1 mmol/L二氯化镁和1 mg/ml X-Gal的PBS液中37℃培养12h。
染色完毕后，生理盐水冲洗组织3次，并将其重新置于含有2%甲醛和0.2%戊二醛的PBS(pH 7.4)液中于4℃固定24h以上。石腊包埋，使用组织切片机将包埋组织切成5μm的切片，核固红(nuclear fast red)染色后显微镜下观察照相。
结果
由于LacZ基因表达的蛋白产物β-半乳糖苷酶与底物X-Gal发生化学反应后呈蓝色，故本实验极易观察到基因是否得到表达及基因表达的部位与范围。图A和C示冠脉灌注法导基因入心脏的组织化学分析结果(图1)。从图A可见LacZ基因在心肌中呈点或小片状表达，组织切片示除心肌中有点状分布的LacZ基因表达外，心脏内血管(图C箭头所示)亦可见LacZ基因表达，但无炎性细胞浸润。图B和D示心肌注射法导基因入心脏的组织化学分析结果。从图B可见LacZ基因沿注射轨迹成块或片状表达，并伴有明显的炎性细胞浸润。而使用两法注射对照腺病毒Adex1w之犬心肌则未见蓝染现象。心肌注射法见有明显的炎性细胞浸润，而冠脉灌注法则未见炎性细胞浸润。
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图1 A 冠脉灌注法导基因入心脏后大体标本(×16)；
B 心肌注射法导基因入心脏后大体标本(×16)；
C 冠脉灌注法导基因入心脏后组织学标本(×50)，箭头示血管蓝染，表明LacZ基因表达；
D 心肌注射法导基因入心脏后组织学标本(×50)；组织中有大量炎性细胞浸润
我们经组织化学分析尚观察到冠脉灌注法导基因犬之肝脏组织有散在呈点状分布的LacZ基因表达，而心肌注射法则不然。说明冠脉灌注法导基因入心脏时，有重组腺病毒随血流遗漏到非靶组织。
讨论
随着心血管分子生物学的兴起，导基因入心脏引人注目。既往研究多侧重于载体选择、导基因后外源基因在心脏中的表达效率及表达时间曲线观察，对方法学及不同方法导基因入心脏的对比研究尚乏报道。本文选用同一载体、同一剂量、同种动物对比研究冠脉灌注法与心肌注射法这两种导基因入心脏方法的不同特点，以其为未来导基因入心脏的基础研究和临床应用提供参考。
, http://www.100md.com
本研究提示冠脉灌注法导基因入心脏具有创伤小，操作简便，可同时将外源基因导入心肌及心肌内血管等优点。适合于以心肌和心肌血管同时为导基因靶组织之研究时应用。但该法导基因入心肌的效率不如心肌注射法，尤其是它可导致外源基因在非靶器官表达，缺乏组织的特异性[3]。为将此法用于未来的临床基因治疗，选用心肌细胞特定启动子和利用心肌细胞特异配体有可能克服此一弊端。
心肌注射法导基因入心脏最初由Dr Li等用于实验研究并引起同道们的极大兴趣[1]，该法能高效率地导基因入心肌局部，其定位性和特异性较好，适合局部心肌为导基因靶组织研究时应用。有希望成为未来的临床基因治疗心脏疾患的主要方法，该法对心肌有一定的损伤作用且可导致局部炎性反应为其不足。有关腺病毒载体导基因入心脏后所致炎症反应机理尚有争议。有作者认为系腺病毒本身侵袭心肌和/或宿主免疫应答所致[4]。但亦有认为系直接心肌注射所致机械性损伤引起[3]。结合本研究结果，我们认为后者的可能性较大。其一，本研究经冠脉灌注法导基因入心脏后未见炎症反应；其二，作者的早期研究使用生理盐水注入心肌亦可引起明显的炎症反应[1]。
, 百拇医药
综上所述，冠脉灌注法和心脏注射法导基因入心脏各有利弊。我们认为应根据研究目的合理选用导入途径。此外，上述二法之弊端亦有待进一步研究克服，以期为未来基因治疗心肌疾病奠定基础。
* 本课题由国家人事部留学回国人员基金资助
参考文献
[1] Li J J,Ueno H,Pan Y,et al.Percutaneous transluminal gene transfer into canine myocardium in vivo by replication-defective adenovirus.Cardiovasc Res，1995,30:97～105.
[2] Lin H,Parmacek MS,Morle G,et al.Expreession of recombinant gene in myocardium in vivo after direct injection of DNA.Circulation,1990,82:2 217～2 224.
, 百拇医药
[3] Barr E,Carroll J,Kalynych AM,et al.Efficient catheter-mediated gene transfer into the heart using replication defective adenovirus.Gene Ther,1994,1:51～54.
[4] Frech BA,Mazur W,Geske RS,et al.Direct in vivo gene transfer into porcine myocardium using replication-deficient adenovirus vector.Circulation,1994,90:2 414～2 426.
[5] Li J J,Ueno H,Yamamoto H,et al.Adenovirus-mediated arterial gene transfer does not require prior injury for submaximal gene expression.Gene Ther,1995,2:351～354.
, 百拇医药
[6] Ueno H,Li J J,Tomita H,et al.Quantitative analysis of gene expression after a repetetive infection into the same arterial wall.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1995,15:2 246～2 253.
[7] 郑志明，见向近敏，郑志明，等主编.医学病毒学.1986，第1版，上海：上海科学技术出版社，538～540.
(1998-05-27收稿)
(1998-09-01修回), 百拇医药